光学显微镜(light microscope)
 
 
  利用可见光(380~760纳米波长)照明,使微小物体放大成像的仪器。这种放大像可用肉眼观察、摄影或用光电管以及其他接受器进行探测。(见图R.虎克在17世纪中期制做的复式显微镜、19世纪中期的显微镜、20世纪初期的显微镜,数值孔径达1.4、带自动照相机的光学显微镜、装有场发射枪的扫描电子显微镜,分辨率为2nm、超高压透射电子显微镜,加速电压可达2000kV)

  基本结构 可分为简单和复式两种类型。简单显微镜即放大镜,放置于物体和肉眼之间,使微小物体放大成虚像。复式显微镜由两组透镜或透镜系统组成。第一组透镜(即物镜)形成物体的放大像,第二组透镜(即目镜)放大第一组透镜形成的像。典型的复式光学显微镜由支架、反光镜、聚光镜、载物台、镜筒、物镜、目镜、以及调节镜筒或载物台移动的机械装置组成。反光镜的作用是使光线通过反射面进入仪器;载物台下的聚光镜,可增强对样品的照明能力;物镜在镜筒中形成一个中间的实像;目镜则放大中间像,在接近样品平面处形成一个虚像(当用肉眼观察时),或在目镜上方的照相底片平面上形成一个实像。

  性能 除了能放大物体外,还应具有良好的分辩力以及形成好的反差像。

  分辨力 指能够分辨出两个相距最近的物点的能力。可由下式表示:

  两物点的最小分辨距离=K·λ/n·sinα
λ为成像光线的波长,n 为样品周围介质的折射率,α是进入物镜光锥的半角,K为常数,约在 0.61~1.0之间,n·sinα 为物镜的数值孔径(常用N.A.表示),用于测定物镜的分辨力。数值孔径越大,能够分辨出二物点之间的距离则越小,因而分辨力就越强。光学显微镜的最小分辨距离为 0.2微米,如果小于这个距离就不能分辨。

  几种特殊类型的光学显微镜

  暗视场显微镜 使用特殊的暗视场聚光镜使照明光线偏移而不进入物镜,只有样品的散射光进入物镜。因而在暗背景上得到亮的像,与暗视场照明相反,照明的光线直接到达成像平面的,称明视场照明。

  暗视场显微镜主要用于观察结构和折射率变化有关的物体,如硅藻、放射虫类、细菌等具有规律结构的单细胞生物以及细胞中的线状结构,如鞭毛、纤维等。用暗视场显微镜还可观察到物镜分辨极限以下的质点,但不适用于观察染色的标本。

  相差显微镜 利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别,把通过物体不同部分的光程差转变为振幅(光强度)的差别,经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。主要用于观察活细胞或不染色的组织切片,有时也可用于观察缺少反差的染色样品。

  干涉显微镜 采用通过样品内和样品外的相干光束产生干涉的方法,把相位差(或光程差)转换为振幅(光强度)变化的显微镜,根据干涉图形可分辨出样品中的结构,并可测定样品中一定区域内的相位差或光程差。由于分开光束的方法不同,有不同类型的干涉显微镜,以及用于测定非均匀样品的积分显微镜干涉仪。干涉显微镜主要用于测定活的或未固定的相互分散的细胞或组织的厚度或折射率。

  荧光显微镜 用激发光照射样品,根据样品产生的荧光进行观察的显微镜。生物学、医学中应用的荧光有自发荧光、诱发荧光(包括酶或化学诱发)、荧光着色、免疫荧光等。荧光显微镜激发光照射的方式,有透射和落射两种。

  显微镜可根据不同用途对各种结构作适当的改变,形成许多其他类型。如比较显微镜、倒置显微镜、解剖体视显微镜、毛细管显微镜以及离心显微镜等。近年来在光学显微术的重大进展是共焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microcope,CLSM)的应用,它大大的提高了影像的反差和分辨力。由于只使物镜焦面上的样品成像,所以可对样品进行“光切片”,并通过计算机样品影像进行三维重组。